Cómo usar PrimerDesigner — Guía rápida

1. Qué es y cómo abrirla

PrimerDesigner diseña y evalúa primers de PCR sin instalar nada y sin enviar datos a ningún servidor: todo el cálculo ocurre en tu navegador. Calcula Tm por el método nearest-neighbor (SantaLucia 1998) con corrección de sales (Owczarzy 2004), el mismo criterio que usan Primer3/Primer-BLAST.

Tiene cuatro pestañas: Diseño, PCR in silico, Base de datos y Ayuda.

2. Diseñar primers

En Diseño, pega la secuencia molde (acepta FASTA e IUPAC). Si te interesa una variante/SNP, escribe su posición (1-based) en el campo correspondiente.

(Opcional) Ajusta parámetros avanzados (longitud, Tm, GC%, amplicón, sales). Los valores por defecto son compatibles con Primer3.

Pulsa Diseñar primers. Verás una tabla de pares ordenados por calidad. Haz clic en una fila para el detalle: Tm, GC%, dG 3', self-dimer, Ta sugerida y enlace a Primer-BLAST.

Si indicaste un SNP, los pares con borde verde cumplen la distancia de lectura Sanger a ambos lados; los de borde rojo no. Puedes guardar el par en la base de datos.

3. PCR in silico y base de datos

PCR in silico: pega molde + tus dos primers (5'→3') y obtén el amplicón predicho, su tamaño y, si das la posición del SNP, las distancias variante↔primer con semáforo de legibilidad Sanger (verde ≥60 nt, ámbar ≥45, rojo <45).

Base de datos: guarda pares con nombre y notas (queda en tu navegador, IndexedDB), y expórtalos a CSV para tu bitácora de oligos.

4. Aplicaciones

Diseño rápido de primers para PCR convencional y secuenciación Sanger de variantes/SNPs.
Comprobar Tm, GC%, dG 3' y auto-dímero de oligos antes de pedirlos.
PCR in silico para anticipar el tamaño de amplicón y dónde cae la variante.
Verificar que una variante sea legible por Sanger (distancia suficiente a cada primer).
Mantener una base de datos local de oligos con notas y exportación a CSV.
Apoyo docente: enseñar cómo Tm, GC y posición afectan el diseño.

5. Limitaciones (léelas)

Esta herramienta es de apoyo al diseño. No sustituye la verificación de especificidad ni la validación experimental.

No verifica especificidad genómica. No alinea contra el genoma; siempre confirma con Primer-BLAST (enlace incluido en cada par) que los primers no peguen en otros sitios.
Tm aproximada. Calculada por nearest-neighbor con sales; puede diferir ±1–3 °C de otros calculadores según parámetros. Validada por rango de plausibilidad, no contra un dataset experimental.
No modela estructuras secundarias completas: no calcula hairpins ni heterodímeros F–R; el "self-dimer 3'" es una heurística simple de complementariedad terminal.
Legibilidad Sanger = regla de distancia (≥60 nt por defecto). Es una guía; la calidad real de lectura depende del equipo, química y plantilla.
PCR in silico simplificada: busca coincidencias con ≤1 mismatch, no modela eficiencia, Ta real, ni amplificación de pseudogenes/variantes alélicas; el amplicón es teórico.
No diseña sobre bases degeneradas (IUPAC). Un molde con muchas N reduce o impide candidatos en esa zona.
No cubre: primers con colas/adaptadores o sitios de restricción, multiplex, qPCR con sondas (TaqMan), bisulfito/metilación, ni primers para clonación tipo Gibson/Golden Gate.
Rendimiento: el cálculo es en el navegador; moldes muy largos pueden tardar.

6. Problemas frecuentes

Síntoma	Solución
"No se encontraron pares"	Relaja parámetros (Tm/GC/amplicón) o, si usas SNP, amplía la secuencia flanqueante (≥60 nt limpios a cada lado) o baja la distancia mínima.
Pocos candidatos en una región	Probablemente hay bases degeneradas (N/IUPAC) ahí: no se diseñan primers sobre ellas.
PCR in silico no da amplicón	Revisa la orientación de los primers (el Reverse va 5'→3' tal como se sintetiza) y sube a ≤1 mismatch.
La Tm no coincide con otro programa	Normal (±1–3 °C): depende de [Na⁺], [Mg²⁺], [dNTP], [oligo] y método. Ajusta las sales a tu PCR real.
No veo la versión nueva	Recarga forzando caché: Cmd+Shift+R.