Tm nearest-neighbor (SantaLucia 1998) + corrección de sales (Owczarzy 2004) · 100% en el navegador, sin servidor — Gallardo BioTools (UANL) · Guía de uso ↗
Tm: método nearest-neighbor de SantaLucia 1998 con corrección de sales monovalentes/Mg²⁺ de Owczarzy 2004 (descuenta el Mg²⁺ quelado por dNTPs). Válido para oligos; coincide en rango con Primer3/Primer-BLAST.
Calidad (0–100): penaliza desviación de Tm respecto al óptimo, GC% fuera de rango, poli-X largos, falta de GC-clamp 3', baja complejidad y estabilidad 3' excesiva (riesgo de mis-priming).
Legibilidad Sanger: si indicas la posición del SNP, se exige que esté dentro del amplicón y a ≥ distancia mínima (def. 60 nt) de cada primer, porque los primeros ~40–60 nt tras el primer caen en la zona de ruido del electroferograma. Los pares que no cumplen se marcan/excluyen.
IUPAC: se aceptan bases degeneradas en el molde (se marcan en ámbar), pero nunca se diseñan primers sobre posiciones degeneradas.
Temperatura de alineamiento (Ta): se reporta la Ta óptima de Rychlik 1990 = 0.3·Tm(primer menos estable) + 0.7·Tm(producto) − 14.9, usando la Tm nearest-neighbor del primer y la Tm del producto (81.5 + 16.6·log₁₀[Na⁺] + 0.41·%GC − 675/N). Es más fiable que la regla simple "Tm − 5", especialmente con amplicones largos o DNA genómico; los autores reportaron concordancia con la Ta experimental dentro de 0.7 °C. Se muestra también la regla −5 como referencia.
Referencias: SantaLucia J. PNAS 1998;95(4):1460-5. DOI:10.1073/pnas.95.4.1460 · Owczarzy R et al. Biochemistry 2004;43(12):3537-54. DOI:10.1021/bi034621r · Rychlik W, Spencer WJ, Rhoads RE. Nucleic Acids Res 1990;18(21):6409-12. DOI:10.1093/nar/18.21.6409
Herramienta de apoyo: verifica siempre especificidad en Primer-BLAST (enlaces incluidos en cada par).